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20130111-全球销售培训-蛋白.pdf

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20130111 全球 销售 培训 蛋白
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基于质谱的蛋白质组学 罗宏敏 luohongmin@genomics.cn 质谱仪 QTRAP5500 TripleTOF5600 LTQ-Orbitrap velos Q Exactive ultrafleXtreme Producer AB Sciex AB Sciex Thermo Thermo Bruker Source-Analyzer ESI-Triple Q ESI-Q-TOF ESI-LTQ-Orbitrap ESI-Q-Orbitrap MALDI-TOF-TOF Resolution 12,000 30,000 100,000 140,000 40,000 Accuracy 50%,对于基因 组小(如微生物,编码几千个蛋白),可达到 40%。 定量蛋白质组学 蛋白组定量分析 植 物 微生物 动 物  致病机 制 耐 药 性原理  生物 /非生物胁迫 …… 生长发 育机制  育 种研究 抗逆、抗病机制 …… 生长发育机 制 动 物疾病机理 筛选生 物标志物 …… 对 多个样品表达的全部 蛋白质进行 定量 比较 , 来研究特定的生命现象 蛋白定量 定量蛋白质组学 基于凝胶 染 色强度 基于质谱 2-DE DIGE 非标法 标记法 体内标记法 体外标记法 15N标 记法 SILAC 峰强度 谱图数 ICAT iTRAQ 基于凝胶染色 强度 —凝胶定量 (2D gel) 凝胶 定量 (DIGE) 体内标记法 1、 15N标记法 在培养基中添加 15N, 细 胞培 养 5-6代后蛋白质将被同位素标记 2、 SILAC法 在 培养基中添 加同 位素标记的 氨基 酸 , 细 胞 培 养 5-6代后 蛋白质将 被同位素标 记 SILAC法 报 告基团 肽反应基团 平衡基团 iTRAQ 简介: iTRAQ 技 术采用 4种或 8种同位素编码 的 等重 标 签 , 通过特异性标记多肽的氨基基团 , 而后进行串联质谱分 析 , 对 4种或 8种样 品中蛋白 质进行相对定量或绝对定量 iTRAQ 结 构: iTRAQ定量原理 27 非标记定量技术 (Label-free) J Biomed Biotechnol. 2010, 2010:840518. 优势 缺点 无需标记 成本高 蛋白鉴定多 定量精度低 不限样品数 周期稍长 与 标记技术 比较 • 峰面积定量法 • 谱图数定量法 定量方法 技术 流程 28 常 见定量蛋白质组方法比 较 方法 体内标记法 体外标记法 2-DE/ DIGE 15N标记 SILAC ICAT iTRAQ Label- free 样本类型 丰度较高 的蛋白 细胞、酵母、细菌 细胞、酵母、细菌 所有样本 所有样本 所有样本 通量 1-2个样品 2个 2-3个 2个 2-8个 多个 蛋白鉴定数 低 中 中 中 中 高 定量准确性 低 中 高 中 高 中 实验经费 低 高 高 中 中 高 定量产品常见问题 1. iTRAQ注意事项 iTRAQ与 2D gel结果的比较 1) iTRAQ通量高,一次可比较 8种样品,节省时间; 2) 两种技术鉴定、定量结果互为补充; 3) iTRAQ定量结果优于 2D gel; 2D gel中一个胶点内含有多种蛋白,不利于 定量分析; 4) iTRAQ标记技术灵敏度由于 2D gel,特别是针对非常相似的样品。 临床分离的 4株结核杆菌,收集其分泌蛋白 2D gel: 120 spots— 25spots iTRAQ: 101和 137个差异蛋白(分泌蛋白和 胞质蛋白) 人肺鳞状细胞癌 biomarkers研究 癌 组织细胞和正常支气管上皮细胞,共鉴 定出 63个差异蛋白 2D gel: 22个差异蛋白 iTRAQ: 59个差异蛋白  定量结果 与其他技术,如 western blot, Elisas会有 差异,但总体趋势应该是一致的。 Mol Cell Proteomics. 2011 Aug;10(8):M110.005686.doi:10.1074 Elisas定量结果 正常现象,两种定量技术不同,一个是从蛋白 层面定量,另一个是从肽段层面,而且也经过 分离。但趋势是一致的 iTRAQ注意事项 1  不推荐组间比较 ——效果不好  Set1的 B与 Set2的 D,不推荐;  或者公共内标 A1、 A2,进行校正 , 目前统计方法还不成熟, 可靠性没有经过严格评估,不推荐  解决方法  压缩实验  用 label free Set 1 A1 B C Set 2 A2 D E  不同物种不能同一批上机  一个物种的蛋白复杂性非常高,多个物种混合提高样品复 杂程度,增加鉴定难度  家蚕夜蛾项目 ,与 其他家蚕项目比较 a.家蚕基因注释的蛋白数据库 b.家蚕和果蝇基因组合并注释的蛋白数据库  例外 1:病原生物研究,需要研究宿主和病原生物的蛋白  例外 2: Meteproteomic,无法分开,更加分析时间来降低 复杂程度 家蚕和夜蛾混合同一批上机 家蚕 546a 1500a 1900a iTRAQ注意事项 2  iTRAQ不能筛选特有 蛋白  iTRAQ技术是一种相对定量技术,给出的结果包含了所有 样品鉴定到蛋白的并集和各组之间蛋白量的比值。  挑选特有蛋白理论上根据标签来区分, 但实际上 iTRAQ试 剂同位素有混杂 , 无严格区分。 目标 蛋白分析 MRM: Multiple Reaction Monitoring 36 Q1 Q2 Q3 技术 流程 37 样 品 检 测 Transition 预测 38 技术应用 技术优势  通量 高  定向性强  灵敏度 高 应用领域  生物标志物 的验证  低丰度蛋白的研究  家族或同源蛋白的研究 39 40 疾病样本 对照样本 定量蛋 白组学 差异蛋白 功能分析 目标蛋 白组学 临床免 疫学检测 蛋白表达 差异分析 候选 biomarker 初筛 候选 biomarker 验证 生物标志物 (biomarker)验证 案例 分析 Nat Biotechnol. 2011 Jun 19;29(7):635-43. doi: 10.1038/nbt.1899. 研究目标: 寻找 心肌梗死相关蛋白 biomarkers。 研究方法: 1) 取 3例心肌肥大病人药物处理 前、中、后 的心脏冠状窦 血, 先 进行 label free定量; 2) 取 外周血进行 AIMS定量 验证,缩小 biomarker候选 范围; 3) 进一步验证: western-blot、 ELASA和 MRM技术。 研究成果: 完整的 biomarker从发现到验证的过程, 验证到 3个 新的 biomarkers: ACLP1, FHL1 and TPM1,并证明该研究思 路的 可行性 。 121个蛋白 52个蛋白 41 蛋白 biomarker研究推荐思路 •发现阶段:潜在 biomarker的鉴定 •样本数:十数量级 •样本来源:组织、体液、血浆、细胞系等 •方法:基于 2D LC-MS/MS的 iTRAQ或 label-free定量分析 预期结果:鉴定到上千种蛋白, 找到 百种差异蛋白 •确认阶段:候选 biomarker的确认 •样本数:十 -百数量级 •样本来源:血浆 ( biomarker检测金标准) •方法:基于 2D LC-MS/MS或 MRM定量分析 预期结果:确认发现阶段找到的 百种差异蛋白,在血浆样本中能 被检测到,并具有表达差异性, 缩小到 几十种 左右蛋白。 •验证阶段:候选 biomarker的验证 •样本数:百 -千数量级 •样本来源:血浆 •方法:基于 MRM的目标蛋白定量分析 预期结果:针对几十种蛋白,在 千数量级的样本中进行验证,评 价候选蛋白的有效性,并缩小到 几种 候选 biomarker指导临床应 用。 42 植物目标蛋白检测 43 J Agric Food Chem. 2011 Apr 27;59(8):3551-8. Epub 2011 Mar 9. Multiplexed protein quantification in maize leaves by liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry: an alternative tool to immunoassays for target protein analysis in genetically engineered crops 首次证明 MRM技 术可应用于植物目 标蛋白的验证 研究意义 实验设计 研究材料:玉米叶片 分别用 MRM和 ELISA技术检测 3个 蛋白 (GAT4621、 zmHRA、 PAT)在 10 个转基因玉米样本中 的表达量 研究成果 1. MRM技术定量线性相关 系数 0.997 2. GAT4621和 zmHRA蛋白 的 MRM定量结果与 ELISA 相当,而 PAT蛋白定量结 果优于 ELISA 3. 证明 MRM技术的重复性 和精确度均很高,且可用 于植物目标蛋白的验证 抗体技术与 MRM技术的比较 抗体技术 MRM 可行性 能否获得抗体 只需要合成肽段 时间 数月或者更长 方法建立仅需 4-6周 通量 一个抗体仅能检测一种 蛋白 可同时对数十个 蛋白 进行 检测 特异性 特异性从低至高不等 较高的特异性 灵敏度 检测灵敏度较低 具有较高的灵敏度 重复性 重复性较低 机器自动筛选 , 重复性高 从基因组过度到蛋白质组的基石,了 解基因的表达情况,样品的蛋白质组 成 不同时期蛋白质组成的变化,寻找差 异蛋白 检测翻译后水平调控,这是无法从 mRNA水平来判断,只能依赖蛋白质 组学 修饰蛋白 质组 定量 蛋白质组 表达蛋白质组 蛋白修饰分析  标准产品  磷酸化蛋白分析 ——磷酸化位点鉴定,磷酸化蛋白鉴定  研发产品  iTRAQ磷酸化定量  糖基化鉴定  乙酰化鉴定 磷酸化蛋白分析 丝氨酸 苏氨酸 酪氨酸 磷酸化 蛋白 磷酸化 位点 工作流 程 蛋白质 酶解 TiO2富集 LC-MS/MS 富集方法多种, 如 IMAC、 TiO2、 酪氨酸抗体, 各有特点 酪氨酸磷酸更 适合采用抗体 富集 intensity 一级质谱 二级质谱  一级质谱,由于磷酸化肽段增加了 HPO3基团,在质谱图上发生 80或 n* 80的质量偏移  二级质谱识别肽段,同时磷酸基团丢失,质量数减少 80或 98Da,根据碎 片离子的质量数判断磷酸化位点 案例 IF 4.1 对于之前没有做过磷酸化的物种、样品,可以先做磷酸化 蛋白鉴定,了解样品的磷酸化程度 样品 :休眠期的白杨芽 ( Populus simonii × P. nigra) 实验方法 : TiO2富集, LC-MS/MS 结果 :鉴定了 151个磷酸化蛋白, 其中 141个磷酸化蛋白与拟南芥同 源 BMC Plant Biol.2011 Nov 11;11:158  标准产品  磷酸化蛋白分析 ——磷酸化位点鉴定,磷酸化蛋白鉴定  研发产品  iTRAQ磷酸化定量  糖基化鉴定  乙酰化鉴定 综合性问题 1. 实验重复问题 2. 关联性问题 重复 的类型 比较组 作用 生物重复 A、 D; B、 E; C、 F 控制生物多样性对实验结果的影响 技术重复 A1、 A2; D1、 D2 控制实验过程中的技术差异性。 上机重复 A11、 A12; A21、 A22 上机重复的数据合并,增加鉴定数, 提高定量准确性 D F E A2 A1 B1 B2 D1 D2 E2 E2 A11 A12 A21 A22 D11 D12 D21 D22 …. …. …. …. 生物重复 技术重复 上机重复 A C B 各蛋白杂志对重复的要求 MCP( IF:7.9) 需要描述数据的生物学可靠性是如何通过生物学重复、统计方法、独立实 验等确定的。 只基于一次生物学实验结果的数据是不能接受的 (除验证生 物学信息系统的数据集以外)。假如基于同一样本来源的生物学重复无法 实现,(如病人样本),合理大量的相似生物学样本进行实验是必要的。 J P( IF: 4.8) 必须提供实验设计,其中包括生物学与重复的次数, 只有一次生物学 /分析 重复是不能被接受的。 在临床研究中,利用适当的样本数为数据做统计分 析是十分可行的。 Proteomics( IF:4.5) 必须提供实验的设计,和生物学重复的次数, 一次生物学重复不能被接受 JPR( IF:5.4) 没有明确提出需要做生物学重复和技术重复,但是 要求能对生物学可信性 和技术可信性进行说明 。 Cell和 nature这两个杂志,没有找到对重复性的硬性要求 ,但是 cell 对实 验的设计要求给出重复次数。 我们的推荐  首选 2-3次生物重复  由于 iTRAQ 8标的要求, 3、 4个样品推荐做 2次生物重复,可以一组上 机,减少不同组上机的差异,更经济  对于样品数 4个的,做生物重复则需要分开上机。 54 J Proteomics.2012 Dec 21;77:154-66  样品量少或者经费限制,可以考虑 pooling样本  减少生物个体差异 vs 掩盖样本真实情况,丢失信息  Pooling不 pooling,是两种意义的 生物重复  无 任何重复,只能其他技术验证结果发表文章 我们的推荐 J Proteomics.2012 Dec 21;77:154-66 综合性问题 1. 实验重复 2. 关联性问题 关联性问题  RNA与蛋白除了正相关外, 还存在负相关和非相关的情况  RNA与蛋白表达量不一致的原因复杂,有以下几条:  蛋白质转运  表达调控作用  蛋白降解与 mRNA降解  翻译效率  低丰度蛋白与 mRNA定量不准确  蛋白质翻译后修饰 Nat Rev Genet. 2011 Jun 28;12(8):518. doi: 10.1038/nrg3037. 1. Schwanhäusser, B. et al. Global quantification of mammalian gene expression control. Nature 473, 337–342 (2011) 相关 性 ~0.4 2. Ghazalpour, A. et al. Comparative analysis of proteome and transcriptome variation in mouse. PLoS Genet. 7, e1001393 (2011) 相关 性 0.27 成功案例 天津大学案例 同一个物种,不同的实验处理,连续发表了 4篇文章 研究材料 : 集胞藻属 (Synechocystis sp. PCC 6803) IF: 6.08 从蛋白水平揭示藻类对己烷的耐受机制 IF: 5.4 从蛋白水平揭示藻类对乙醇的耐受机制 从蛋白水平揭示藻类对丁醇的耐受机制 IF: 4.8 利用蛋白质组技术探究假想蛋白的功 能 IF: 2.3 技术路线 : iTRAQ,8标。 Con-24h、 treat-24h、 con-48h、 treat-48h, 两次生物重复 Part 1 蛋白鉴定数  鉴定到 1452个蛋白,覆盖到 40%的预测蛋白  对于基因组小(如微生物,编码几千个蛋白),可达到 40%  差异蛋白数 乙醇处理差异蛋白 24h 48h 己烷处理 140 148 乙醇处理 135 293 丁醇处理 126 177 丁醇处理差异蛋白  结果讨论部分 利用蛋白组学技术探究假想蛋白胁迫应激 功能 研究背景: 据蓝细菌基因组推测,共有 3178个蛋 白,其中未知蛋白占 47% 研究路线: 1) 利用丁醇、乙醇、己烷、 Nacl和氮缺乏分别 处理藻类; 2) Itraq 8-plex, 22种蛋白在五种刺激中均发 生差异表达; 3) 未知蛋白功能预测:转录组数据 +22种差异 蛋白( WGCNA, String) 研究成果: 1)对其中 8种差异蛋白进行了功能的初探; 2)为未知功能蛋白的预测提出一种新思路。 Part 2
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