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【可编辑】细胞迁移侵袭实验操作步骤(Transwell).doc

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可编辑 编辑 细胞 迁移 侵袭 实验 操作 步骤 Transwell
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迁移实验(cell migration assay)实验介绍细胞迁移与侵袭实验将Transwell小室放入培养板中,小室内称上室,培养板内称下室,上下层培养液以聚碳酸酯膜相隔,将研究的细胞种在上室内,由于聚碳酸酯膜有通透性,下层培养液中的成分可以影响到上室内的细胞,应用不同孔径和经过不同处理的聚碳酸酯膜,就可以进行共培养、细胞趋化、细胞迁移、细胞侵袭等多种方面的研究。实验步骤:1材料准备:可拍照显微镜,Transwell小室,孔径8μm,没包被胶的(Coster和Corning公司的也较常用),Transwell迁移实验的细胞培养板24孔板。细胞培养板应当与购买的Transwell小室相配套,BD公司的Matrigel,无血清DMEM,(1%胎牛血清)DMEM和1640培养基,DMEM完全培养基,1640完全培养基(也可加到20%血清),无菌PBS,棉签,胰酶,4%多聚甲醛固定液或者甲醇,结晶紫染液(0.1%(g/ml)PBS结晶紫)2步骤和流程2.1基质胶铺板:用BD公司的Matrigel 1:8(根据细胞产生mmp的量来决定)稀释,包被Transwell小室底部膜的上室面,置37℃30min使Matrigel聚合成凝胶。使用前进行基底膜水化。2.2制备细胞悬液①制备细胞悬液前可先让细胞撤血清饥饿12-24h,进一步去除血清的影响。但这一步并不是必须的。②消化细胞,终止消化后离心弃去培养液,(用PBS洗1-2遍),用含BSA的无血清培养基重悬。调整细胞密度至5×105/ml。2.3接种细胞①取细胞悬液100µl加入Transwell小室。②24孔板下室一般加入600µl含20%FBS的培养基,特别注意的是,下层培养液和小室间常会有气泡产生,一旦产生气泡,下层培养液的趋化作用就减弱甚至消失了,在种板的时候要特别留心,一旦出现气泡,要将小室提起,去除气泡,再将小室放进培养板。③培养细胞:常规培养12-48h(主要依癌细胞侵袭能力而定)。24h较常见,时间点的选择除了要考虑到细胞细胞侵袭力外,处理因素对细胞数目的影响也不可忽视。2.4结果统计直接计数法,“贴壁”细胞计数,这里所谓的“贴壁”是指细胞穿过膜后,可以附着在膜的下室侧而不会掉到下室里面去,通过给细胞染色,可在镜下计数细胞。取出Transwell小室,弃去孔中培养液,用无钙的PBS洗2遍,甲醇固定30分钟,将小室适当风干。0.1%结晶紫染色20 min,用棉签轻轻擦掉上层未迁移细胞,用PBS洗3遍。400倍显微镜下随即五个视野观察细胞,记数。实验材料(1)Transwell chamber: 24-well, 8.0-μm pore membranes (Corning) (2)细胞培养相关试剂:无血清培养基,10%血清培养基,PBS,0.02%EDTA(3)固定液:甲醇(4)染色液:Giemsa染液(5)封片剂:中性树胶(6)其他:小镊子,棉棒,载玻片,盖玻片操作步骤(1)所有细胞培养试剂和Transwell chamber 放在37℃温育;(2)待测细胞培养至对数生长期,消化细胞,用PBS和无血清培养基先后洗涤一次,用无血清培养基悬浮细胞,计数,调整浓度为2×105 /ml;(3)在下室(即24孔板底部)加入600-800μl 含10%血清的培养基,上室加入100-150μl细胞悬液,继续在孵箱培养24小时;(4)用镊子小心取出chamber,吸干上室液体,移到预先加入约800μl甲醇的孔中,室温固定30分钟;(5)取出chamber,吸干上室固定液,移到预先加入约800μl Giemsa染液的孔中,室温染色15-30分钟;(6)轻轻用清水冲洗浸泡数次,取出chamber,吸去上室液体,用湿棉棒小心擦去上室底部膜表面上的细胞;(7)用小镊子小心揭下膜,底面朝上晾干,移至载玻片上用中性树胶封片;(8)显微镜下取9个随机视野计数,统计结果。注意事项(1)根据待测细胞体积大小选择合适孔径的chamber。常用的为8.0-μm孔径(如AGS细胞),如果细胞体积较大可以考虑用10-μm孔径;(2)根据待测细胞的迁移能力强弱调整细胞数和迁移时间。常规24-well chamber接种细胞数约为2≈5×104/well,迁移时间12≈36小时;(3)由于Corning公司的24-Transwell内含12个独立的chamber,为了避免操作污染,每次实验可预先另准备一块24孔普通培养板(Corning);(4)如果细胞迁移能力较弱,下室液体可用3T3细胞无血清培养24小时获得的上清加50μg/ml FN(Fibronectin),具体可查阅相关文献;(5)细胞悬液加入膜中央,尽量保证液面水平;(6)固定染色擦洗时动作小心,避免擦去膜底面的细胞。但一定要充分擦净膜表面上未迁移的细胞,以免影响读数。尤其是膜周边上可用细牙签或小镊子缠上湿棉花擦洗,但要小心避免将膜戳破;(7)Chamber和膜上都无法标记,操作时应小心避免混淆实验组和对照组;(8)充分晾干,避免残留水分导致镜下聚焦不一致。细胞侵袭实验 (cell invasion assay)实验材料(1)Matrigel (BD 5mg/ml),-20℃保存(2)其余材料同迁移实验操作步骤(1)Matrigel在4℃过夜融化;(2)用4℃预冷的无血清培养基稀释Matrigel至终浓度1mg/ml,冰上操作;(3)在chamber上室底部中央垂直加入100μl稀释后的Matrigel,37℃温育4-5小时使其干成胶状;(4)后续步骤同迁移实验(1-8)。注意事项(1)Matrigel在过高或过低的温度均易凝固,因此操作所需枪头和离心管应提前在4℃预冷;(2)铺胶时保证液面水平,胶的厚度均匀一致,切勿产生气泡;(3)其他注意事项同迁移试验。其他Transwell做肿瘤侵袭实验的具体步骤(1) 基质胶准备:将冻存于-80度冰箱的BD matrigel 4度过夜(24h),变成液态;(2)取300ul无血清培养基,加入60ul(或50ug/每室)Matrigel ,混匀,( 4℃操作,最好在冰浴上),加入上室各100ul(3个室);放入37℃培养箱中,孵育4-5h(>5h);此间经常观察,当出现“白色层”时,说明已经变为固态。注释:无血清培养基和基质胶按1:5稀释,每孔加50ul,在37℃培养箱中1-2h。(3)消化细胞,无血清培养基洗3次,计数,配成细胞悬液;(4)用无血清培养基洗 Matrigel洗1次;每孔加入100ul细胞悬液;(5)下腔室中加入500ul含有20%FBS条件培养基;(6)37℃培养箱中,孵育20-24h;(7)取出transwell用PBS洗2遍, 5%戊二醛固定,4℃;(8)加入结晶紫(0.1%)染色或Giemsa染色(5-10min),室温0.5h,PBS洗2遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察。 迁移实验transwell在24孔板中浸泡1小时;消化细胞,无血清培养基 洗 2 次,计数,配成 细胞悬液,每孔加入100ul细胞悬液;加药刺激;下腔室中加入条件培养基或其他刺激因子;37℃培养箱中,孵育 20-24h;取出 transwell用 PBS洗2遍,5% 戊二醛固定, 4℃;PBS洗2遍,加入结晶紫(0.1%)染色,室温0.5h,PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察计数 10 照相,记录。侵袭实验取 300ul 无血清培养基 ,加入 30ul (或 50ug/ 每室) Matrigel ,混匀,( 4 ℃ 操作,最好在冰浴上),加入上室各 100ul ( 3 个室); 放入 37 ℃ 培养箱中,孵育 4-5h ( >5h ); 消化细胞,无血清培养基洗 3 次,计数,配成 细胞悬液 ;用无血清培养基洗 Matrigel 洗 1 次;每孔加入 100ul 细胞悬液;下腔室中加入 600ul 无血清 条件培养基;37 ℃ 培养箱中,孵育 20-24h;取出 transwell 用 PBS 洗 2 遍, 5% 戊二醛固定, 4 ℃ ;PBS 洗 2 遍,加入结晶紫( 0.1% )染色,室温 0.5h , PBS 洗 2 遍,用棉球擦去上表面细胞,显微镜下观察 transwell小室是否可以重复利用,该怎样消毒用棉签轻轻擦去胶和反面细胞,清水冲洗,超声清洗,低挡,30min,清水3×5min,蒸馏水3×5min,室温凉干,用前紫外线小室正面3h,反面6h,微波,低火10min×2,效果很好。
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